超高靈敏度和特異性miRNA定量方法——雙尾RT-qPCR

前情回顧：miRNA絕對定量的唯一方法——miREIA

越來越多的研究表明，miRNA是許多人類病理學中有潛力的診斷和預后生物標志物，但如何準確對miRNA進行定量檢測一直是個難題。

上一期我們講到過miRNA的免疫定量的方法——miREIA，介紹了通過免疫法定量miRNA的試劑盒，但目前常規用于miRNA定量的試劑盒都是基于PCR法的，我們有沒有基于PCR法的miRNA檢測試劑盒呢，肯定是有的，今天小艾給大家帶來了升級版的基于PCR法的miRNA定量檢測試劑盒——雙尾RT-qPCR。

市面上常見的miRNA定量檢測試劑盒原理

BioVendor專利產品——雙尾RT-qPCR

我們專利的雙尾RT-qPCR技術，具有獨特的RT引物機制，與其他方法相比，可提供出色的靈敏度和特異性。雙尾RT-qPCR技術已被開發用于總的miRNA和piRNA的定量。

雙尾RT-qPCR原理：與使用單個結合探針不同，雙尾PCR使用兩個半探針，它們分別結合到不同的microRNA片段上，這些片段通過折疊的系鏈連接。雖然每個半探針本身都很短, 無法結合到microRNA上，但當兩個半探針互補時，它們會協同結合，這種結合的特異性是非常高的，因為在短半探針中錯配的影響非常大。然后可以使用兩個特定序列引物對形成的cDNA進行PCR擴增，用SYBR進行檢測。

雙尾RT-qPCR優勢：

高靈敏度（最多少于10個分子）

高特異性

適合于多種樣本（血漿/血清，血液，組織等）中的miRNA檢測和定量

通過折疊的系鏈連接的兩個半探針（結合不同的microRNA片段）

動態范圍廣（高達9 log）

在進行單重qPCR之前，可進行雙管多重RT-PCR

提供定制化服務

1.高靈敏度及特異性：

5?互補片段顯著提高分析的靈敏度：

5? 互補片段顯著提高檢測的特異性：

5′-hemiprobe的特異性及靈敏度驗證：為了測試5′-hemiprobe對特異性的貢獻，我們比較了兩種雙尾RT引物區分Let-7 miRNA家族的兩個成員：Let-7a和Let-7f的能力，它們僅有位于miRNA序列中心的單個核苷酸的差異。RT 1引物的5'-hemiprobe設計成與let-7a的5'-末端的前十個核苷酸結合， 而RT 2引物的5'-hemiprobe結合在let-7a的8個核苷酸上，通過這種設計，區分let-7a和let-7f的核苷酸只是由RT 2引物的5′-hemiprobe檢測的，而不是由RT 1引物檢測的。RT 2引物的5′-hemiprobe也很短（8個核苷酸），因為我們認為探針序列較短時錯配的影響會更加明顯。其余的RT 1和RT 2引物序列以及所用的PCR引物是完全相同的。使用RT 2引物時，完全匹配和錯配的模板之間的ΔCq（ΔCq= 11.07）顯著大于使用RT 1引物（ΔCq = 4.66），不帶有5′-hemiprobe的不同堿基重疊的RT 2引物，而不是不帶有RT 1引物的RT 2引物。這證明了5'-半探針對系統特異性的重大貢獻。值得注意的是，兩種雙尾RT引物完全互補的let-7a microRNA的Cq值相等，表明即使5′-hemiprobe的長度有兩個堿基的不同，檢測靈敏度仍然相同。

2.適用樣本類型豐富：

3.檢測流程簡便：

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