越來越多的研究表明,miRNA是許多人類病理學中有潛力的診斷和預后生物標志物,但如何準確對miRNA進行定量檢測一直是個難題。
上一期我們講到過miRNA的免疫定量的方法——miREIA,介紹了通過免疫法定量miRNA的試劑盒,但目前常規用于miRNA定量的試劑盒都是基于PCR法的,我們有沒有基于PCR法的miRNA檢測試劑盒呢,肯定是有的,今天小艾給大家帶來了升級版的基于PCR法的miRNA定量檢測試劑盒——雙尾RT-qPCR。
市面上常見的miRNA定量檢測試劑盒原理
BioVendor專利產品——雙尾RT-qPCR
我們專利的雙尾RT-qPCR技術,具有獨特的RT引物機制,與其他方法相比,可提供出色的靈敏度和特異性。雙尾RT-qPCR技術已被開發用于總的miRNA和piRNA的定量。
雙尾RT-qPCR原理:與使用單個結合探針不同,雙尾PCR使用兩個半探針,它們分別結合到不同的microRNA片段上,這些片段通過折疊的系鏈連接。雖然每個半探針本身都很短, 無法結合到microRNA上,但當兩個半探針互補時,它們會協同結合,這種結合的特異性是非常高的,因為在短半探針中錯配的影響非常大。然后可以使用兩個特定序列引物對形成的cDNA進行PCR擴增,用SYBR進行檢測。
雙尾RT-qPCR優勢:
高靈敏度(最多少于10個分子)
高特異性
適合于多種樣本(血漿/血清,血液,組織等)中的miRNA檢測和定量
通過折疊的系鏈連接的兩個半探針(結合不同的microRNA片段)
動態范圍廣(高達9 log)
在進行單重qPCR之前,可進行雙管多重RT-PCR
提供定制化服務
1.高靈敏度及特異性:
5?互補片段顯著提高分析的靈敏度:
5? 互補片段顯著提高檢測的特異性:
5′-hemiprobe的特異性及靈敏度驗證:為了測試5′-hemiprobe對特異性的貢獻,我們比較了兩種雙尾RT引物區分Let-7 miRNA家族的兩個成員:Let-7a和Let-7f的能力,它們僅有位于miRNA序列中心的單個核苷酸的差異。RT 1引物的5'-hemiprobe設計成與let-7a的5'-末端的前十個核苷酸結合, 而RT 2引物的5'-hemiprobe結合在let-7a的8個核苷酸上,通過這種設計,區分let-7a和let-7f的核苷酸只是由RT 2引物的5′-hemiprobe檢測的,而不是由RT 1引物檢測的。RT 2引物的5′-hemiprobe也很短(8個核苷酸),因為我們認為探針序列較短時錯配的影響會更加明顯。其余的RT 1和RT 2引物序列以及所用的PCR引物是完全相同的。使用RT 2引物時,完全匹配和錯配的模板之間的ΔCq(ΔCq= 11.07)顯著大于使用RT 1引物(ΔCq = 4.66),不帶有5′-hemiprobe的不同堿基重疊的RT 2引物,而不是不帶有RT 1引物的RT 2引物。這證明了5'-半探針對系統特異性的重大貢獻。值得注意的是,兩種雙尾RT引物完全互補的let-7a microRNA的Cq值相等,表明即使5′-hemiprobe的長度有兩個堿基的不同,檢測靈敏度仍然相同。
2.適用樣本類型豐富:
血漿/ 血清/ 尿液/ 腦脊液/ 生物液體 | 新鮮組織,冷凍/福爾馬林固定組織的 |
細胞,外泌體 |
3.檢測流程簡便:
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