冠狀病毒“生命”周期中的細胞骨架互作

       冠狀病毒超家族（Coronaviridae）包括幾類具有大RNA編碼基因組的人類病原體，例如流感，普通感冒和病毒性腦炎，它們被分為α，β和γ冠狀病毒家族，并進一步分為A，B ，和C型別。COVID-19被歸類為與SARS-CoV高度相似的B型冠狀病毒，因此，它最近更名為SARS-CoV-2。盡管人們在1960年才記錄了β冠狀病毒家族的第一批成員，但該家族中新增的人類強致病性病原體數量在過去20年中迅速增加，目前已達到6個，最新的有SARS（嚴重急性呼吸系統綜合癥，2002年），MERS（中東呼吸系統綜合癥，2012年），以及目前正在流行的COVID-19 / SARS-CoV-2。

 

 

      在這里，我們一起來了解一下病毒“生命”周期與細胞骨架的相互作用的四個階段：

 

       第一階段：病毒入侵

 

      冠狀病毒感染的第一階段是Spike（S）蛋白質介導的通過Spike（S）蛋白質附著到細胞表面的神經酰胺酸部分（具有9個碳原子的酸性碳水化合物）或硫酸乙酰肝素。這種感染策略非常有效，因為在所有哺乳動物細胞表面上存在許多類型的受體分子，從而為質膜附著創造了豐富的條件。結合后，病毒顆粒通過調節FAK / Cofilin / Rac / Cdc42途徑主動重新排列細胞骨架。

 

      呂等人在體外對小鼠腦神經元（N2a）細胞進行冠狀病毒PHEV給藥后，顯示出絲狀偽足，片狀脂質體和應激纖維比例隨著時間波動。在5min內，應激纖維被消耗殆盡，而絲狀偽足占主導，占總鬼筆環肽熒光信號的80％。在20-40min之間，lameopodia與絲狀偽足平分秋色，最終在60min時，比例恢復到接近正常水平，即60％的信號是應激纖維。盡管這是從宏觀角度進行觀察，但這在納米尺度上表明病毒體可能會創建一個調節其自身進入的局部環境。在另一份研究報告中，Owczarek等人對人類大腸腺癌細胞（HCT-8）進行冠狀病毒OC43給藥來研究內陷法，膀胱切除術對F-Actin功能影響。Milewska等人也描述了類似的病毒入侵研究，通過其他機制，例如小窩依賴的內陷或胞飲作用，病毒感染率取決于細胞表面的病毒載量。細胞入侵過程中也會將病毒體包被在靠近細胞核的囊泡中。

 

 

      冠狀病毒進入細胞-復制-組裝-釋放的示意圖（改編自Simpson和Yamauchi，2020）

 

 

      用PHEV冠狀病毒處理或未處理的HCT-8細胞5min，固定細胞并用Acti-stain 488（綠色，細胞骨架），抗PHEV外殼蛋白（紅色）和DNA（藍色，Hoescht）染色。B圖：感染冠狀病毒，A圖：未感染。

 

      Note：感染樣本中細胞外圍的染色水平很高，表明有片狀脂膜病和絲狀偽足（窄峰）。與未感染的細胞樣本相比，這表明細胞質染色顏色深，表明有應激纖維。（上圖由He Wenqi教授提供，來自Lv et al.2019）。

 

       第二階段：轉運

 

      在第二階段，一些研究揭示了肌動蛋白和微管蛋白都是細胞內轉運的互補細胞骨架成分。Owczarek等人探討了F-Actin在細胞內定位中的功能，jasplakinolide（一種細胞可滲透的F-肌動蛋白穩定化合物）抑制了病毒入侵過程中病毒顆粒的質膜結合，而cytochalsin D（一種F-actin的解聚化合物）并沒有抑制病毒的入侵，但擾亂了病毒體從周圍核到細胞質區域的正常定位。冠狀病毒刺突蛋白C末端肽（S蛋白）以冠狀病毒株特異性方式與幾種β-tubulin亞型結合，混亂的肽顯示結合不是由于隨機的離子電荷相互作用。因此，病毒體在細胞內轉運是利用多種細胞骨架結構蛋白來進行導航并定位到細胞內的特定區域的。

 

       第三階段：組裝和成熟

 

      病毒體被轉運到核周區域后，冠狀病毒RNA從囊泡和病毒粒子中滲出，進入細胞核進行逆轉錄和復制。DNA復制子隨后被轉錄稱RNA，并從細胞核進入高爾基體/ ER /微管組織中心。最初，核衣殼（N）蛋白與RNA拷貝結合并與囊泡膜結合，然后N和E蛋白進一步成熟，這是組裝基本病毒樣顆粒（VLP）所需的。如果Spike（S）蛋白是共表達的，則它會摻入病毒顆粒中。在多種細胞骨架和膜調節蛋白協同作用下（例如HDAC6，泛素和Rab GTPases）通過濃縮包裝組分來輔助組裝。

 

       第四階段：釋放

 

      冠狀病毒核衣殼或棘突蛋白與GFP的遺傳融合使得可以通過熒光顯微鏡跟蹤非感染性病毒顆粒。Siu等使用這種技術監測SARS-CoV釋放，發現了融合成多顆粒團塊的囊泡。該轉運對布雷菲德菌素A敏感，表明正在利用分泌途徑。其他研究發現諾考達唑可有效抑制病毒體向質膜的轉運，表明微管是病毒釋放出口的重要組成部分。Rab11涉及到KHC綁定以進行微管運輸，然后與肌球蛋白結合，以幫助橫穿眼周肌動蛋白基質并從細胞中釋放出來。

 

       小結：

 

      總的來說，冠狀病毒通過質膜附著和內陷進入細胞的方式有很多種，隨后，肌動蛋白，微管蛋白及其化學機械動力中的動力蛋白，動力蛋白和肌球蛋白細胞骨架成分都需要進行細胞內轉運到正確的位置進行復制。逆轉錄和轉錄后，將正鏈RNA包裝在高爾基體/ ER /微管復合體的支架上。囊泡包裹的病毒粒子沿著微管移動，然后與質膜融合并逃出細胞。冠狀病毒研究中的許多方法都使用試劑，在這里我們為您推薦熒光鬼筆環肽，微管和肌動蛋白抑制試劑盒，動力蛋白，驅動蛋白，以及各類小G蛋白（Rac，Cdc42）活化測定研究工具。

 

      冠狀病毒研究中有許多未解決的問題。例如，病毒體是如何通過質膜相互作用調節細胞骨架以協調其進入？單個病毒體可以自己進入細胞嗎？將肌動蛋白和微管細胞骨架用于不同功能的意義何在？與流行性感冒和普通感冒相比，這種病毒為何能躲避免疫系統追蹤這么久？這些問題的解答無疑將在將來給我們帶來更多的認知和可能的藥理學突破。

 

      G-LISA 活化檢測試劑盒：

 

    

       鬼筆環肽：

 

     

       Actin生化試劑盒：

 

     

      Tubulin生化試劑盒：

 

 

     1.Gorbalenya, A.E., Baker, S.C., Baric, R.S. et al. The species Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus: classifying 2019-nCoV and naming it SARS-CoV-2. Nat Microbiol (2020). https://doi.org/10.1038/s41564-020-0695-z.

     2.Vijgen, L. et al. 2005. Complete genomic sequence of human coronavirus OC43: molecular clock analysis suggests a relatively recent zoonotic coronavirus transmission event. J Virol i79,i1595–1604, https://doi.org/10.1128/JVI.79.3.1595-1604.

     3.Ren et al. 2015. Genetic drift of human coronavirusOC43 spike gene during adaptive evolution. Scientific Reports, 5, 11451.

     4.Lv et al. 2019. Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus activation of the integrin a5b1-FAK-cofilin pathway causes cytoskeletal rearrangement to promote its invasion of N2a cells. J. Virol. 93 (5), 1-19. doi: org/10.1128/JVI.01736-18.

     5.Owczarek et al. 2018. Early events during human coronavirus entry to the cell. Scientific Reports, 8, 7124, 1-11. doi: 10-1038/s41598-018-25640-0.

     6.Milewska,A.et al. 2014. Human coronavirus NL63 utilizes heparan sulfate proteoglycans for attachment to target cells. J Virol 88, 13221–13230, https://doi.org/10.1128/JVI.02078-14.

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